Číslo a názov VE VE 06-01 ANALÝZA DNA POLYMORFIZMU KOLEKCIE GENOFONDU RASTLÍN
Zodpovedný vedúci Ing. Veronika ŠTEFÚNOVÁ, Katedra genetiky a šľachtenia rastlín, Agronomická fakulta, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre
Riešiteľský kolektív prof. RNDr. Milan Bežo, CSc. - Katedra genetiky a šľachtenia rstlín, AF SPU
Ing. Veronika Štefúnová - Katedra genetiky a šľachtenia rastlín, AF SPU
Ing. Jana Kutišová - Katedra genetiky a šľachtenia rastlín, AF SPU
Beata Marenčáková - Katedra genetiky a šľachtenia rastlín, AF SPU
Monika Bírová - Kattedra genetiky a šľachtenia rastlín, AF SPU
Základné ciele A/ Analýza DNA polymorfizmu kolekcie genofondu ľanu (Linum L.)

Vytvorenie systému množenia rastlín ľanu (Linum L.) v kultúre in vitro podľa schémy "semeno - klíčenec" pre odber vzoriek na izoláciu DNA.
Optimalizácia podmienok PCR (polymerázovej reťazovej reakcie) pre RAPD (polymorfizmus náhodne zmnoženej DNA) analýzu genofondu ľanu. Optimalizáciu zamerať na určenie:
a) koncentrácie DNA,
b) koncentrácie prajmera,
c) koncentrácie DNA polymerázy,
d) koncentrácie deoxyribonukleotidov,
e) koncentrácie MgCl2,
f) teplotného profilu PCR.

Analýza genetických rozdielov na molekulovej úrovni metódou RAPD a AFLP medzi genotypmi olejných, olejno-priadnych a priadnych foriem druhov kolekcie genofondu ľanu.
Zhodnotenie vhodnosti metódy RAPD a AFLP pre analýzu variability a genetickej príbuznosti v rámci rodu ľan (Linum L.)
Priebežné budovanie databázy DNA odtlačkov jednotlivých genotypov (odroda, šľachtiteľský materiál, pestovaný materiál, krajové odrody a divorastúce formy) ľanu pre zabránenie duplicity položiek v génovej banke.
Vytvorenie databázy informácií o genetickej vzdialenosti alebo príbuznosti jednotlivých genotypov na základe RAPD a AFLP markérov pre šľachtiteľské využitie.


B/ Analýza DNA polymorfizmu kolekcie genofondu láskavca (Amaranthus L.)

Vytvorenie systému množenia rastlín láskavca (Amaranthus L.) v kultúre in vitro podľa schémy "semeno - klíčenec" pre odber vzoriek na izoláciu DNA
Určenie molekulovej rozdielnosti medzi druhmi Amaranthus caudatus, Amaranthus cruentus, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus retroflexus, Amaranthus spinosus, Amaranthus tuberculatus, Amaranthus viridis, Amaranthus aff. blitum, Amaranthus albus, Amaranthus arenicola, Amaranthus blitoides, Amaranthus blitum a Amaranthus rudis z kolekcie genofondu rodu láskavec metódami RAPD, ISSR (zmnoženie oblastí medzi jednoduchými opakovaniami nukleotidov) a AFLP (polymorfizmus dĺžky amplifikovaných fragmentov).
Určenie variability medzi kultúrnymi a divorastúcimi formami v rámci druhov Amaranthus caudatus, Amaranthus cruentus, Amaranthus hypochondriacus, Amaranthus palmeri, Amaranthus retroflexus, Amaranthus spinosus, Amaranthus tuberculatus, Amaranthus viridis, Amaranthus aff. blitum, Amaranthus albus, Amaranthus arenicola, Amaranthus blitoides, Amaranthus blitum a Amaranthus rudis z kolekcie genofondu rodu láskavec metódami RAPD, ISSR a AFLP.
Zhodnotenie vhodnosti metódy RAPD, ISSR a AFLP pre analýzu variability a genetickej príbuznosti v rámci rodu láskavec (Amaranthus L.).
Priebežné budovanie databázy DNA odtlačkov jednotlivých genotypov (odroda, šľachtiteľský materiál, pestovaný materiál, krajové odrody a divorastúce formy) láskavca pre zabránenie duplicity položiek v génovej banke.
Vytvorenie databázy informácií o genetickej vzdialenosti alebo príbuznosti jednotlivých genotypov na základe RAPD, ISSR a AFLP markérov pre šľachtiteľské využitie.
Vlastná metodika A/ Návrh vlastného postupu riešenia a jeho zdôvodnenie:
Založenie kultúr in vitro zo semien jednotlivých druhov a genotypov kolekcie genofondu ľanu (Linum L.) a láskavca (Amaranthus L.). Množenie jednotlivých druhov a genotypov kolekcie genofondu ľanu a láskavca podľa schémy "semeno - klíčenec".

Odber rastlinného pletiva - listov z rastlín, kultivovaných v podmienkach in vitro. Izolácia genomickej DNA podľa autorov Rogers et al. (1994), Sul et al. (1996) a Edwards et al. (1991). Výber vhodnej metódy pre ďalšie izolácie.

Optimalizácia podmienok PCR a priebeh PCR pre analýzu polymorfizmu náhodne zmnoženej DNA (RAPD) genotypov ľanu a láskavca. Elektroforéza produktov RAPD v agarózovom géle, farbenie DNA etídium bromidom a vizualizácia polymorfizmu náhodne zmnoženej DNA v transiluminátore. Dokumentácia elektroforeogramov RAPD produktov digitálnym obrazom. Výpočet indexu podobnosti (Nei a Li, 1979) a Jaccardovho koeficienta (Rohlf, 1994) pre hierarchickú zhlukovú analýzu metódou UPGMA (štatistický program SYNTAX).

Priebeh PCR pre analýzu polymorfizmu zmnožených oblastí medzi jednoduchými opakovaniami nukleotidov (ISSR) genotypov láskavca. Elektroforéza produktov ISSR v agarózovom géle, farbenie DNA etídium bromidom a vizualizácia polymorfizmu náhodne zmnoženej DNA v transiluminátore. Dokumentácia elektroforeogramov RAPD produktov digitálnym obrazom. Výpočet indexu podobnosti (Nei a Li, 1979) a Jaccardovho koeficienta (Rohlf, 1994) pre hierarchickú zhlukovú analýzu metódou UPGMA (štatistický program SYNTAX).

Analýza polymorfizmu dĺžky amplifikovaných fragmentov (AFLP) medzi genotypmi ľanu a láskavca. Štiepenie genomickej DNA často a menej často štiepiacou reštrikčnou endonukleázou, ligácia adaptérov. Preselektívna PCR s prajmermi komplementárnymi k adaptérom. Selektívna PCR s prajmermi komplementárnymi k adaptérom, obohatenými o 2-3 nukleotidy. Analýza amplifikovaných fragmentov v polyakrylamidovom géle. Farbenie gélu striebrom. Dokumentácia elektroforeogramov na duplikátne kilmy. Výpočet indexu podobnosti (Nei a Li, 1979) a Jaccardovho koeficienta (Rohlf, 1994) pre hierarchickú zhlukovú analýzu metódou UPGMA (štatistický program SYNTAX).

B/ Prostredie a miesto riešenia úlohy:
Úloha bude riešená na Katedre genetiky a šľachtenia rastlín AF SPU v Nitre. Čiastkové úlohy, týkajúce sa explantátových kultúr budú realizované v Laboratóriu explantátových kultúr. Úlohy, zamerané na molekulovú biológiu, budú realizované v Technologickom Laboratóriu a v Laboratóriu molekulovej biológie KGŠR AF SPU v Nitre.

C/ Spôsob realizácie prác:
Práce budú realizované podľa metodického postupu v laboratórnych podmienkach

D/ Popis spôsobu zberu experimentálnych údajov a záznamov:
Podklady pre štatistické spracovanie budú získané fotodokumentáciou elektroforeogramov RAPD, ISSR a AFLP produktov.

E/ Spôsob spracovania a vyhodnocovania experimentálnzch údajov:
Výpočet indexu podobnosti (Nei a Li, 1979) a Jaccardovho koeficienta (Rohlf, 1994) ako podkladov pre hierarchickú zhlukovú analýzu metódou UPGMA (štatistický program SYNTAX).

F/ Originalita riešenia:
Použitie DNA analýzy pre zhodnotenie variability zbierky genofondu ľanu a láskavca.

Realizačné výstupy Realizačným výstupom RAPD, ISSR a AFLP analýzy budú genetické odtlačky jednotlivých genotypov z kolekcie genofondu ľanu (Linum L.) a láskavca (Amaranthus L.).
Publikačná činnosť


Hore