Číslo a názov VE	VE 06-02 MORFOMETRICKÁ A DNA ANALÝZA SEMIEN GENOFONDU LIPNICE LÚČNEJ
Zodpovedný vedúci	Ing. Martin BEŽO, CSc., Katedra genetiky a šľachtenia rastlín, Agronomická fakulta, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre
Riešiteľský kolektív	doc. Ing. Ján Brindza, CSc. - Katedra genetiky a šľachtenia rstlín, AF SPU Ing. Martin Bežo, CSc. - Katedra genetiky a šľachtenia rastlín, AF SPU Ing. Štefan Hajdu - Katedra genetiky a šľachtenia rastlín, AF SPU Ing. Jana Kutišová - Katedra genetiky a šľachtenia rastlín, AF SPU Beata Marenčáková - Katedra genetiky a šľachtenia rastlín, AF SPU Monika Bírová - Kattedra genetiky a šľachtenia rastlín, AF SPU
Základné ciele	Cieľom vecnej etapy vedecko-technického projektu C519/3 - D 118/VTPC/1998 Záchrana a ochrana genofondu starých a krajových odrôd z rastlinných druhov na Slovensku je na základe teoretických poznatkov a vlastných experimentálnych výsledkov hodnotiť na základe obrazovej dokumentácie, metód molekulovej biológie a štatistickej analýzy, genofond a osivo vybraných odrôd lipnice lúčnej (Poa pratensis L.). 1. Spracovanie obrazovej dokumentácie morfologických charakteristík zrna genofondu lipnice lúčnej (Poa pratensis L.). 2. Spracovanie obrazovej dokumentácie morfologických charakteristík zrna v kategóriách a generáciách osiva vybraných odrôd lipnice lúčnej (Poa pratensis L.). 3. Analýza genetickej rozmanitosti a príbuznosti jednotlivých genotypov rodu lipnica (Poa L.) na základe hodnotenia polymorfizmu DNA metódou RAPD a AFLP. 4. Analýza genotypovej a fenotypovej stability populácie v kategóriách a generáciách osiva (SE1, E, C1 a S) lipnice lúčnej (Poa pratensis L.) hodnotenej na základe polymorfizmu DNA a morfometrických analýz. 5. Spoznanie variability a biologických zákonitostí medzi morfologickými znakmi na úrovni zrna hodnoteného genofondu s využitím štatistických metód. 6. Inovácia klasifikátora pre hodnotenie a klasifikáciu znakov na úrovni zrna. 7. Vývoj metodiky pre identifikáciu genotypových rozdielov na úrovni zrna.
Vlastná metodika	1/ Návrh vlastného postupu riešenia a jeho zdôvodnenie: Založenie porastu v podmienkach in vivo so semien lipnice (Poa. L.). Založenie kultúr in vitro zo semien jednotlivých druhov a genotypov kolekcie genofondu lipnice (Poa L.). Množenie jednotlivých druhov a genotypov kolekcie genofondu lipnice podľa schémy "semeno - klíčenec". Odber rastlinného pletiva - listov z rastlín kultivovaných v podmienkach in vitro. Izolácia genomickej DNA podľa autorov Rogers et al. (1994), Dellaport. Výber vhodnej metódy pre ďalšie izolácie. Optimalizácia podmienok PCR a priebeh PCR pre analýzu polymorfizmu náhodne zmnoženej DNA (RAPD) genotypov lipníc. Elektroforéza produktov RAPD v agarózovom géle, farbenie DNA pomocou EtBr a vizualizácia polymorfizmu náhodne zmnoženej DNA v transiluminátore. Dokumentácia elektroforeogramov RAPD produktov fotografiou a digitálnym obrazom. Výpočet indexu podobnosti (Nei a Li, 1979) a Jaccardovho koeficienta (Rohlf, 1994) ako podkladov pre hierarchickú zhlukovú analýzu metódou UPGMA (štatistický program SYNTAX). Analýza polymorfizmu dĺžky amplifikovaných fragmentov (AFLP) medzi genotypmi lipníc. Štiepenie genomickej DNA často a menej často štiepiacou reštrikčnou endonukleázou, ligácia adaptérov. Preselektívna PCR s prajmermi komplementárnymi k adaptérom. Selektívna PCR s prajmermi komplementárnymi k adaptérom, obohatenými o 2-3 nukleotidy. Analýza amplifikovaných fragmentov v polyakrylamidovom géle. Farbenie gélu striebrom. Dokumentácia elektroforeogramov na duplikátne kilmy. Výpočet indexu podobnosti (Nei a Li, 1979) a Jaccardovho koeficienta (Rohlf, 1994) ako podkladov pre hierarchickú zhlukovú analýzu metódou UPGMA (štatistický program SYNTAX). Hodnotenie morfologických a fyziologických vlastností sa bude realizovať podľa klasifikátora pre trávy http://www.ars-grin.gov/npgs/descriptors/grass. Klasifikátor bude podľa potrieb upravený a prispôsobený pre hodnotenie lipníc (Poa. L.). Na hodnotenie fenotypovej variability bude použitá nedštruktívna metóda počítačového zobrazenia. Pomocou citlivej kamery sa zaznamenaný obraz digitalizuje v počítači a vyhodnocuje sa priamo programom PRIMA alebo sprostredkovane, meraním na obrazovke pomocou prídavného monitora 2/ Prostredie a miesto riešenia úlohy: Úloha bude riešená na Katedre genetiky a šľachtenia rastlín AF SPU v Nitre. Čiastkové úlohy, týkajúce sa explantátových kultúr budú realizované v Laboratóriu explantátových kultúr. Poľné pokusy budú realizované na pokusníckych pozemkoch Katedry genetiky a šľachtenia rastlín AF SPU a v Šľachtiteľskej stanici v Levočských lúkach. Úlohy, zamerané na molekulovú biológiu budú realizované v Technologickom Laboratóriu a v Laboratóriu molekulovej biológie KGŠR AF SPU v Nitre. 3/ Spôsob realizácie prác: Práce budú realizované podľa metodického postupu v laboratórnych a v poľných podmienkach. 4/ Popis spôsobu zberu experimentálnych údajov a záznamov: Podklady pre štatistické stracovanie budú získané fotodokumentáciou elektroforeogramov RAPD a AFLP produktov. Údaje morfologických a fyziologických vlastností budú ziskavané pomocou pozorovania a budú zaznamenané digitálnymi kamerami. 5/ Spôsob spracovania a vyhodnocovania experimentálnzch údajov: Výpočet indexu podobnosti (Nei a Li, 1979) a Jaccardovho koeficienta (Rohlf, 1994) ako podkladov pre hierarchickú zhlukovú analýzu metódou UPGMA (štatistický program SYNTAX). Výsledkom práce bude vypracovanie databázy genofondu lipníc (Poa. L.), ktorý bude obsahovať popis morfologických znakov rastlín, semenárske vlastnosti, porovnanie príbuznosti alebo odlišnosti genotypov odrôd. 6/ Originalita riešenia: Použitie morfometrických, semenárskych, molekulových analýz na hodnotenie genofondu lipníc (Poa L.)
Realizačné výstupy	Výstupom práce bude obrazová dokumentácia, ktorej súčasťou budú údaje o morfologických, fyziologických, semenárskych vlastnostiach semena a rastlín lipnice (Poa L.). Realizačným výstupom RAPD a AFLP analýzy budú DNA odtlačky jednotlivých genotypov z kolekcie genofondu lipníc (Poa L.)
Publikačná činnosť